提高原代培養人關節韌帶成纖維細胞成活率的核心是減少組織/細胞損傷、模擬體內微環境、嚴格控制污染，需從組織獲取到原代培養的全流程優化，具體方法如下：

一、源頭優化：組織獲取與預處理 —— 減少初始損傷

原代細胞的成活率從組織離體時就已決定，這一步的關鍵是縮短缺血時間、避免機械損傷去除雜質。

1、縮短組織離體到處理的時間：

韌帶組織離體后需立即放入含4℃預冷、添加雙抗和 10% FBS的 Hank's 液中，1 小時內轉移至實驗室處理。低溫和血清可暫時維持細胞代謝，雙抗能預防初期污染，避免組織因長時間缺血缺氧導致細胞大量死亡。

2、輕柔處理，避免機械損傷：

剪碎組織時用鋒利的無菌手術剪刀，采用“反復剪切”而非“擠壓式剪切”，將組織切成1mm3 以內的細小碎塊（越小越易接觸消化液，但避免過度碾壓導致細胞破裂）。

清洗組織時用 PBS 緩慢沖洗，避免用力搖晃離心管，減少細胞因機械摩擦脫落或受損。

3、去除非韌帶組織：

用鑷子仔細剔除韌帶表面的脂肪、血管、滑膜等雜質 —— 這些組織不僅會引入雜細胞（如脂肪細胞、內皮細胞），還可能釋放有害物質，抑制成纖維細胞活性，甚至導致培養基變質。

二、核心關鍵：消化過程 —— 溫和解離，避免過度損傷

原代細胞死亡的主要原因之一是消化過度，需采用“分步消化 + 實時觀察”的策略，平衡“解離效率”和“細胞活性”。

1、選擇溫和的消化體系：

優先使用“膠原酶 I + 白酶”兩步消化法，而非單一消化 —— 膠原酶 I 能特異性分解韌帶組織中的膠原纖維，對細胞表面損傷小；胰蛋白酶僅用于后續松散細胞的解離，減少對細胞的直接破壞。

2、嚴格控制消化時間與溫度：

膠原酶消化：37℃水浴振蕩，時間控制在2-3 小時（根據組織硬度調整，髕韌帶較硬可延長至 3 小時，交叉韌帶較軟可縮短至 2 小時），每隔 30 分鐘用吸管輕輕吹打 1 次，觀察到組織塊邊緣開始松散即可，避免消化至“糊狀”。

胰酶消化：加入胰蛋白酶后，37℃孵育不超過10 分鐘，并在倒置顯微鏡下實時觀察 —— 當看到 50% 以上細胞變圓、脫離組織塊時，立即加入2 倍體積含 FBS 的培養基終止消化。

3、過濾與離心的細節把控：

用 70μm 細胞篩過濾時，用含培養基的吸管輕輕沖洗篩網，避免用力擠壓殘留組織塊，防止未消化的細胞被壓碎。

離心時設置1000rpm、5 分鐘（室溫），轉速過高會導致細胞沉淀壓實，細胞膜破裂；離心后棄上清時，保留 1mL 左右培養基，避免吸管直接接觸細胞沉淀，減少細胞丟失。

三、環境模擬：培養條件 —— 復刻體內生長微環境

原代成纖維細胞對體外環境敏感，需通過優化培養基成分和培養環境，提高細胞貼壁率和增殖活性。

1、定制化培養基：

基礎培養基選擇DMEM/F12（1:1）（營養更全面，適合原代細胞），并添加以下成分（按終濃度）：

15% 胎牛血清（FBS，需選擇低內毒素、高批次一致性的產品，滅活后使用，提供生長因子和營養）；

5ng/mL 堿性成纖維細胞生長因子（bFGF，促進成纖維細胞增殖，減少細胞凋亡）；

1μg/mL 胰島素（維持細胞代謝活性，尤其適合離體后代謝較弱的原代細胞）；

1% 青霉素 - 鏈霉素（雙抗，預防細菌污染，避免因污染導致細胞批量死亡）。

注意：培養基需提前 37℃預熱，避免冷培養基刺激剛解離的細胞。

2、優化培養環境參數：

CO?培養箱：嚴格維持37℃、5% CO?、95% 濕度—— 溫度波動不超過 ±0.5℃（溫度過低會抑制代謝，過高會導致細胞變性）；CO?濃度不足會導致培養基 pH 升高（變紫），過高會導致 pH 降低（變黃），均會影響細胞活性；濕度不足會導致培養基蒸發過快，滲透壓升高，細胞脫水死亡。

接種后的“靜置期”保護：細胞接種后，前24 小時內不移動培養皿—— 原代成纖維細胞貼壁需要時間（通常 6-12 小時開始貼壁，24 小時完成初步貼壁），移動會導致未貼壁細胞懸浮、聚集，降低貼壁率。

四、污染防控：全程無菌 —— 避免“一票否決”式損失

污染是原代培養失敗的主要原因之一，一旦發生細菌、真菌或支原體污染，幾乎所有細胞都會死亡，需從操作到環境全程把控。

1、操作前的無菌準備：

超凈工作臺提前 30 分鐘開啟紫外消毒，操作前用 75% 乙醇擦拭臺面、雙手（戴無菌手套）和所有耗材表面（培養皿、移液管等）。

試劑瓶開啟后，瓶口用酒精燈火焰消毒，避免瓶口直接接觸臺面或吸管，使用后的試劑及時密封，防止污染。

2、操作中的細節規避：

避免在超凈工作臺內放置過多物品，保持氣流穩定；操作時吸管、鑷子等工具避免跨越無菌區（如從污染的廢液缸上方越過培養皿）。

處理組織和細胞時，動作要輕、快，減少培養皿開蓋時間，避免外界空氣進入（空氣中的微生物可能落入培養基）。

3、培養過程中的監測：

每天在倒置顯微鏡下觀察細胞狀態，同時觀察培養基顏色 —— 若發現培養基渾濁、出現白色/黃色絮狀物（細菌污染）或黑色/綠色斑點（真菌污染），需立即將污染培養皿移出培養箱，并用 75% 乙醇消毒后丟棄，避免污染擴散；若懷疑支原體污染（細胞生長緩慢、形態變圓，培養基無明顯變化），可通過支原體檢測試劑盒確認，陽性則需丟棄細胞，消毒培養箱。

五、后期維護：接種后管理 —— 減少二次損傷

細胞接種后的維護直接影響貼壁率，需避免因操作不當導致已貼壁細胞脫落或凋亡。

1、換液的時機：

接種后48 小時進行換液，過早換液會導致未貼壁細胞被沖走，過晚換液會導致未貼壁的死細胞釋放有害物質，影響已貼壁細胞。換液時用 PBS 輕輕沖洗細胞表面 1 次（避免直接沖擊細胞），再加入新鮮預熱的培養基。

2、避免頻繁移動培養皿：

除換液和觀察外，盡量不移動培養皿，尤其是在細胞貼壁初期（前 3 天），頻繁移動會導致培養基晃動，使剛貼壁的細胞再次脫落。

3、及時傳代，避免過度密集：

當細胞生長至培養皿表面積的70%-80% （細胞間有少量空隙，未匯合）時及時傳代 —— 過度密集會導致細胞競爭營養，出現接觸抑制，不僅增殖緩慢，還會增加細胞凋亡率；傳代時同樣遵循“溫和消化”原則，避免損傷細胞。

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