百歐博偉生物：污染是細胞培養中一個大敵，一旦污染，前功盡棄。決定要進行細胞培養，首先一定要有強烈的無菌意識，操作中要遵守嚴格的操作規程，不要怕麻煩，越細心越好。

一般情況下，如果你的細胞被細菌污染了，培養皿或瓶中的細胞狀態很快就會發生變化，表現為胞漿中出現大量的顆粒，液體渾濁、培養基PH下降，變成黃色，貼壁細胞形態變圓、會脫壁死亡；而受到真菌污染的細胞，細胞狀態并不會馬上發生變化，培養3-4天后，可能才會在培養皿中看到白色的漂浮物或者黑色的小點兒。

一、常見細胞培養污染判別

1、真菌污染

真菌種類多，形態各異，但污染后均不難發現，大多呈白色或淺黃色小點漂浮于培養液表面，肉眼可見；有的散在生長，鏡下觀察呈絲狀、管狀或樹枝狀菌絲，縱橫交錯穿行于細胞之間。念珠菌和酵母菌呈卵圓形態，散在于細胞周邊和細胞之間生長。

2、細菌污染

污染后大多能改變培養液pH培養液變混濁，毒性大的細菌很快導致細胞崩解死亡。加用抗生素的培養用液一般可預防和排除個別少量細菌的污染。細菌在普通倒置顯微鏡下為黑色細沙狀，根據感染細菌的不同，可有不同的外形，培養液一般會渾濁變黃，對細胞生長影響明顯。

3、支原體污染

支原體(Mycoplasma)是一種沒有細胞壁的原核生物，大小約0.3-0.8微米。目前，已發現的支原體品種有100多種。

細胞培養的支原體污染來源主要有

(1)細胞之間的交叉污染，這是支原體污染的最主要原因；

(2)細胞培養操作人員的口腔、皮膚等；

(3)細胞培養用的組分，如血清、培養液等；

4、黑膠蟲污染

黑膠蟲可以穿透濾膜，也可以通過空氣傳播，低倍下為黑色點狀，高倍下可看見黑色的小蟲游來游去，培養液也是不渾的，一般不會太影響，細胞還是可以用的。常常是細胞生長狀態良好，且觀測到的運動物無明顯增多，且培養液顏色、透明度無明顯變化，可在同一批號的血清養的細胞中發現類似現象。

二、常見細胞培養污染判別及應對措施

細胞培養中的常見污染主要包括：細菌、霉菌、支原體、黑膠蟲、病毒和交叉污染等，每一種污染都有各自的特點。如細菌和霉菌增殖迅速，短時間就對細胞造成明顯傷害；而支原體和病毒對細胞的影響則是一種緩慢長期的過程。下面就具體看看每一種污染。

1、細菌污染(較容易被發現)

引起原因：操作不規范或無菌措施不到位等；

細菌污染種類：白色葡萄球菌，大腸桿菌，假單孢菌、枯草桿菌等；

（1）細胞污染后的變化

①污染后由于有大量酸性物質產生，因此培養基會短時間內由紅色變為黃色；

②由于細菌大量增殖，培養基變渾濁，稍微振蕩后可見培養基表面有漂浮物；

③普通倒置顯微鏡高倍鏡觀察，胞漿內可見大量顆粒(如下圖紅色箭頭)；

④細胞生長緩慢，逐漸變圓脫落。

如下圖所示：左：懸浮細胞污染后，可見懸浮細胞個體遠大于桿狀細菌，而細菌呈黑色顆粒狀并會有較快的運動速度；右：貼壁細胞，可看到球狀細菌分布于細胞周圍并做劇烈運動。

（2）處理措施

在培養液中添加雙抗(P/S)處理；可用抗生素的常用量的5~10倍作沖擊療法，用藥24~48h后再換常規培養液；

另外添加西司他丁鈉和亞胺培南(泰能)處理細胞，適用于培養用具被打翻、使用了污染的培養液或要培養污染的組織或者凍存細胞的污染情況。

裸鼠體內接種法是比較有效和的除菌方法。主要包括腹水接種和皮下荷瘤分離細胞。既能清除污染細菌，又能保持腫瘤細胞的來源特征和惡性特性。對于一些特別珍貴的腫瘤細胞，可采用裸鼠體內接種法。

2、霉菌污染(較容易被發現)

引起原因：操作不規范或無菌措施不到位等；

污染種類：白色念珠菌，酵母菌，黑霉菌，曲霉菌，孢子菌等；

（1）細胞污染后的變化

①一般來說，培養液不會變渾濁；

②比較容易發現，肉眼可見點狀菌落(淡黃色或者白色)漂浮在培養基表面(如下圖左)；

③普通倒置顯微鏡下觀察，可見絮狀交錯的菌絲或菌團生長在細胞之間；有時真菌并不是直接分布于細胞貼壁層，需要通過調整顯微鏡仔細觀察尋找菌絲或菌團(如下圖右)。

如下圖所示：懸浮細胞U397的霉菌污染，黃色圓形發亮的是U397；紅色箭頭：霉菌的菌絲和孢子囊，特別的是孢子釋放出來后是難以被酒精殺死。

（2）處理措施

添加制霉菌素和兩性霉素B，但是對細胞的毒性也較大；

環境消毒：先后用酒精、新潔爾擦洗培養箱；水盤加上飽和量的硫酸銅。

若細胞不是特別珍貴，建議丟棄。

3、支原體污染(難被發現)

支原體是一種自然界中能獨立生活的最小微生物，能通過細菌濾器，在細胞培養過程中，支原體感染發生率很高。由于支原體可以與細胞共存，生長速率受影響較小，而被忽視。支原體污染在細胞培養污染中隱蔽和最難察覺，但是支原體能明顯影響宿主細胞代謝、RNA合成及基因表達的作用，因此越來越受到重視。

引起原因：主要來源于是已感染支原體細胞之間的交叉污染，支原體感染的血清和胰酶等；

（1）細胞污染后的變化

①培養液不變渾濁，但會很快變成黃色；

②多數細胞在形態方面少有明顯變化；

③在倒置顯微鏡下可見胞漿出現小顆粒或空泡；

（2）處理措施

定期用支原體試劑盒檢測；

換液可以減緩污染情況，但無法；

支原體清除試劑盒可以達到較好效果；

小鼠腹腔巨噬細胞清除法。

4、黑膠蟲污染

引起原因：往往來源于血清；

（1）細胞污染后的變化

①低倍鏡下觀察時可見黑色小點，高倍鏡下可見到其做布朗運動，像小蟲游來游去；

②細胞培養液仍然清亮，污染較輕時對細胞無影響；若太多就會對細胞造成影響。

（2）處理措施

更換血清；增加細胞密度，提高細胞的生長率。

5、病毒污染

引起原因：病毒可能來自于血清；

（1）細胞污染后的變化

①污染后培養液無明顯變化；

②大部分細胞也不會有明顯的形態變化；

6、交叉污染

引起原因：兩種或兩種細胞以上的實驗同時進行，實驗器具、試劑等混用而易造成的污染；

檢測手段：可通過鏡檢觀察細胞形態是否與所培養細胞形態一致來判斷，另外還可以通過各種免疫學試驗、同功酶分析及細胞遺傳學方法來確定。

處理方式：針對病毒和交叉污染較難清除，建議丟棄細胞重新培養；

學會對各種污染情況的辨別和處理是一項的實驗技能，希望大家在看完我們的文章后結合你的實驗操作，學會如何應對細胞污染。

北京百歐博偉生物技術有限公司擁有Biolog微生物鑒定系統，超低溫冰箱，生物安全柜等儀器設備可進行對微生物分離、鑒定等常規的分子實驗研究。對我國生命科學研究、生物技術創新和產業發展的需求進行積極的面對社會乃至國外收集保藏提供微生物菌種資源。在保證生物安全和保護知識產權的前提下，為工農業生產、衛生健康、環境保護、科研教育提供微生物物種資源、基因資源、信息資源和專業技術服務。

除此之外，我們還擁有對菌種、細胞、培養基、配套試劑等產品需求者的極優質服務，對購買項目的前期資料提供,中期合同保證,后期貨物跟蹤到最終售后的確保項目準確到位，都有相關人士進行維護,確保您在微生物菌種查詢網中獲得優質服務！也正因為此，北京百歐博偉生物技術有限公司與國內外多家研制單位、生物制藥、第三方檢測機構和科研院所院校、化工企業有著良好、長期和穩定的合作關系！