近年來(lái)，基于親和配體或質(zhì)譜技術(shù)（MS）的血漿蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展，在診斷或預(yù)后的潛在生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)中起到越來(lái)越大作用，特別是質(zhì)譜血漿蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域取得了尤為顯著的進(jìn)步，但這些生物標(biāo)志物的臨床驗(yàn)證和應(yīng)用仍受限于依賴過(guò)時(shí)的三重四極桿質(zhì)譜技術(shù)。因此，一種新型的質(zhì)譜方法技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生，大大提高了生物標(biāo)志物的驗(yàn)證和轉(zhuǎn)化效率。

2025年8月13日，Molecular & Cellular Proteomics （MCP）雜志在線發(fā)表了丹麥哥本哈根大學(xué)Matthias Mann 教授組與Thermo Fisher Scientific色譜質(zhì)譜部團(tuán)隊(duì)題為“A novel hybrid high speed mass spectrometer allows rapid translation from biomarker candidates to targeted clinical tests using 15N labeled proteins”的論文。

研究評(píng)估了一種新型的高通量混合質(zhì)譜儀——Thermo Scientific™ Stellar™質(zhì)譜儀（Stellar MS），在血漿蛋白質(zhì)組學(xué)應(yīng)用中的工作流程，使用短梯度即可快速定量分析數(shù)千條目標(biāo)肽段，覆蓋超過(guò)1000種血漿蛋白。它將三重四極桿的穩(wěn)健性與強(qiáng)大的線性離子阱質(zhì)量分析器相結(jié)合，能夠進(jìn)行極快速且靈敏的平行反應(yīng)監(jiān)測(cè)（PRM）和MS3多級(jí)掃描模式。Stellar MS可針對(duì)原本在Orbitrap Astral MS上測(cè)量的數(shù)千種肽段進(jìn)行靶向分析，具備高靈敏度、高特異性、重現(xiàn)性好等特點(diǎn)。此外，絕對(duì)定量通常是臨床檢測(cè)的要求，因此研究團(tuán)隊(duì)利用15N 標(biāo)記的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品，還開發(fā)了一套快速、簡(jiǎn)單易用的針對(duì)酒精相關(guān)肝病（ALD）生物標(biāo)志物的定量方法，展示了 Stellar MS 在臨床應(yīng)用中的潛力。最終研究結(jié)果表明，Stellar MS 能夠無(wú)縫銜接蛋白質(zhì)組學(xué)的鑒定與常規(guī)的臨床檢測(cè)，從而有助于蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物在診斷和預(yù)后的應(yīng)用。

文章重點(diǎn)

● Stellar MS血漿蛋白生物標(biāo)志物分析流程的介紹

● 從DIA數(shù)據(jù)鑒定結(jié)果到PRM目標(biāo)方法的建立

● 數(shù)以千計(jì)條目標(biāo)肽段的高通量分析

● 血漿中15N重標(biāo)蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的評(píng)價(jià)

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在本研究之前，三重四極桿質(zhì)譜儀以其結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單卻效果顯著而聞名，仍是蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物靶向檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)。它靈敏度高和穩(wěn)定性好，對(duì)于可靠的臨床診斷至關(guān)重要，并且易于與同位素標(biāo)記標(biāo)準(zhǔn)品配合使用以實(shí)現(xiàn)絕對(duì)定量。然而，掃描模式僅限于使用選擇或多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)（SRM/MRM），而非采集整張 MS/MS譜圖。這一局限性在一定程度上，阻礙了蛋白質(zhì)組學(xué)從發(fā)現(xiàn)向臨床應(yīng)用的轉(zhuǎn)化，而且方法開發(fā)必須依賴標(biāo)準(zhǔn)品，通量上也滿足不了大規(guī)模肽段進(jìn)行同時(shí)定性定量的需求，即便實(shí)現(xiàn)了足夠的特異性和靈敏度，整個(gè)分析過(guò)程通常也需要數(shù)月之久。

因此，本研究探索了一種全新的工作流程，以開始解決上述挑戰(zhàn)。Stellar MS旨在將三重四極桿的易用性與先進(jìn)的雙壓線性離子阱質(zhì)量分析器的優(yōu)點(diǎn)融為一體。與三重四極桿的最后一個(gè)四極桿相比，線性離子阱捕獲了肽段離子的所有碎片，然后快速獲得碎片離子的質(zhì)譜圖。這個(gè)過(guò)程其實(shí)我們已經(jīng)非常熟悉，而且臨床上已經(jīng)被廣泛接受，不同的是規(guī)模大大增加了，并具有平行碎片積累和全掃描質(zhì)量分析，同時(shí)實(shí)現(xiàn)定量和定性的優(yōu)勢(shì)，這有望實(shí)現(xiàn)前所未有的靈敏度、特異性和速度，包括平行反應(yīng)監(jiān)測(cè)（PRM）和MS3多級(jí)掃描能力。

此外，Stellar MS可方便結(jié)合15N全長(zhǎng)重組蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的使用，快速建立可靠的定量體系。與基于肽段的同位素標(biāo)記不同，這種標(biāo)準(zhǔn)品減少了酶切和樣品制備過(guò)程帶來(lái)的波動(dòng)性，可提高定量準(zhǔn)確度。15N標(biāo)記還減少了MS2質(zhì)譜圖的潛在干擾，提高了碎片離子的定量可靠性。這種方法有望檢測(cè)出蛋白質(zhì)的不同形式和翻譯后修飾類型，增強(qiáng)蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物的診斷潛力。

最后，研究團(tuán)隊(duì)還利用Stellar MS方法中自適應(yīng)實(shí)時(shí)保留時(shí)間校正功能（Adaptive RT），以一個(gè)很窄的保留時(shí)間窗口（RT window），將從Orbitrap Astral MS鑒定到的全部血漿肽段轉(zhuǎn)移到PRM方法中，并描述了如何優(yōu)先選擇最特異性的肽段進(jìn)行最終的靶標(biāo)分析。本研究最后獲得了一組15N標(biāo)記的肝病蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物，有望推進(jìn)臨床上肝病通用檢測(cè)的前景。

樣本信息：病人血漿

前處理：Neat plasma，spike-in 15N標(biāo)記蛋白，Trypsin酶切

上樣量：500 ng或250 ng酶切肽段

Orbitrap Astral MS方法

納升液相：Evosep One liquid chromatography (LC) system (Evosep Biosystems) 

色譜柱：8 cm IonOptics Aurora Rapid column (8cm, 150 μm ID, 1.7 μm C18)，60SPD，柱溫50°C

質(zhì)譜儀：Orbitrap Astral mass spectrometer (Thermo Fisher Scientific)

離子源：Easy-spray with FAIMS Pro  (Thermo Fisher Scientific)  

采集模式：DIA

Stellar方法

在Stellar MS上使用了gas-phase-fractionation  DIA （GPF DIA）進(jìn)行蛋白鑒定，跟Orbitrap Astral MS的結(jié)果可進(jìn)行對(duì)比，另外，分別建立PRM Targeted MS2/MS3 LC-MS方法進(jìn)行靶標(biāo)蛋白分析。

納升液相：Evosep One liquid chromatography (LC) system (Evosep Biosystems) 

色譜柱：8 cm ionOptics Aurora Rapid column (8cm, 150 μm ID, 1.7 μm C18)，60SPD，柱溫50°C

質(zhì)譜儀：Stellar MS (Thermo Fisher Scientific)

離子源：Easy-spray with FAIMS Pro (Thermo Fisher Scientific) 

采集模式：GPF DIA （6個(gè)），Adaptive RT DIA

采集模式：tMS2，Adaptive RT DIA

采集模式：tMS3，Adaptive RT DIA

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使用Skyline和PRM conductor進(jìn)行靶標(biāo)母離子的選擇

PRM方法相對(duì)于SRM/MRM方法的一大優(yōu)勢(shì)就是方法建立更加簡(jiǎn)單快捷，只需要有母離子列表就可以建立儀器采集方法，進(jìn)行樣品數(shù)據(jù)的采集，而不需要先獲得標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行離子對(duì)的參數(shù)優(yōu)化。目前，我們可以通過(guò)三種方式創(chuàng)建Stellar MS的靶標(biāo)肽段分析方法（如下圖所示），本研究中，主要是評(píng)價(jià)了前兩種方式，即基于 Orbitrap Astral MS或Stellar MS的肽段鑒定結(jié)果，篩選出母離子列表，從而建立PRM方法。

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在這個(gè)過(guò)程中，研究人員使用了Skyline軟件及其外置工具PRM conductor （Thermo Fisher Scientific, Inc.開發(fā)）來(lái)完成，只需要四步就可以輕松將不同搜索引擎獲得的鑒定結(jié)果轉(zhuǎn)化成PRM母離子列表（如圖所示）。

步驟一：Orbitrap Astral MS DIA數(shù)據(jù)分析。可使用Proteome Discoverer/Chimerys、DIA-NN或Spectronaut軟件進(jìn)行檢索，本研究中主要使用了DIA-NN 1.9.1進(jìn)行DIA數(shù)據(jù)的分析，另外Stellar MS采集的GPF DIA數(shù)據(jù)，通過(guò)Proteome Discoverer/Chimerys進(jìn)行數(shù)據(jù)檢索。

步驟二：Skyline 譜庫(kù)的建立。將檢索結(jié)果文件導(dǎo)入Skyline進(jìn)行建庫(kù)，然后導(dǎo)入DIA原始數(shù)據(jù)進(jìn)行提峰。

步驟三：tMS2/tMS3母離子列表的創(chuàng)建。使用PRM conductor進(jìn)行靶標(biāo)肽段的過(guò)濾，設(shè)置靶標(biāo)分析方法參數(shù)，最后軟件自動(dòng)導(dǎo)出PRM母離子列表（并生成Adaptive RT reference *.rtbin文件，用于保留時(shí)間實(shí)時(shí)校準(zhǔn)），建立PRM儀器方法。

步驟四：Stellar tMS2/MS3數(shù)據(jù)采集和分析。結(jié)合Adaptive RT采集PRM數(shù)據(jù)，可使肽段采集窗口更準(zhǔn)確，然后導(dǎo)入PRM數(shù)據(jù)到Skyline，再次使用PRM conductor進(jìn)行過(guò)濾，并創(chuàng)建新的PRM方法用于最終的樣品分析。

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結(jié)果展示

此前，通常使用三重四極桿質(zhì)譜儀進(jìn)行靶標(biāo)分析。從概念上講，其布局很簡(jiǎn)單，首先在第一個(gè)四極桿中選擇母離子，然后在第二個(gè)四極桿中進(jìn)行碰撞碎裂，在第三個(gè)四極桿中選擇子離子（離子對(duì)）（如論文圖 1A）。由于一次只能檢測(cè)一個(gè)子離子，因此在給定時(shí)間可測(cè)量的離子對(duì)數(shù)量有限。獲取完整的 MS/MS 全譜效率極低，從而影響定性能力或降低通量。因此，在靶向 MS 檢測(cè)中，通常只監(jiān)測(cè)最強(qiáng)且特異最高的子離子，每個(gè)肽段為三到五個(gè)。

如今，本研究使用了這款新型的高通量混合質(zhì)譜儀 Stellar MS 采用了類似的設(shè)計(jì)原則，但其第三個(gè)質(zhì)量分析器并非四極桿，而是采用了雙壓線性離子阱（LIT）（如論文圖 1 B），單位質(zhì)量分辨率下，質(zhì)量分析掃描速率可達(dá) 125 kDa/s，是一些高端三重四極桿質(zhì)譜儀的6倍或以上，tMS2和tMS3掃描速度分別為140Hz和40Hz，另外具備離子阱質(zhì)量分析器獨(dú)特的MSn多級(jí)掃描，可高達(dá)MS10。硬件上還沿用了OT Astral MS的光電倍增器（PMT），兩邊是一對(duì)高能轉(zhuǎn)換打拿極，能帶來(lái)優(yōu)異的檢測(cè)靈敏度和穩(wěn)定性，以及超長(zhǎng)的使用壽命。

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亮點(diǎn)1：

Stellar MS同時(shí)具備優(yōu)異的定性和定量能力，可實(shí)現(xiàn)DDA/DIA/PRM等掃描模式，所以在靶向蛋白分析方法的開發(fā)中，研究人員也評(píng)價(jià)了從Stellar鑒定結(jié)果到PRM方法的流程，結(jié)果表明，使用GPF DIA可實(shí)現(xiàn)很好的鑒定結(jié)果，并通過(guò)PRM conductor可篩選出質(zhì)量很高的肽段母離子用于靶標(biāo)分析。（如論文圖2A所示）

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結(jié)果表明，兩種檢測(cè)方法的定量重復(fù)性都較為相似，基于Stellar MS的檢測(cè)方法中，接近 85% 的肽段變異系數(shù)低于 20%，而基于OT Astral MS的檢測(cè)方法中，75% 肽段變異系數(shù)低于 20%（如論文圖4C）。另外，兩種流程獲得基本一致的鑒定準(zhǔn)確率（如論文圖4e、f）。

亮點(diǎn)2：

新型的 Stellar MS在靶向蛋白檢測(cè)中表現(xiàn)出了優(yōu)異的靈敏度和重現(xiàn)性。研究團(tuán)隊(duì)對(duì)血漿標(biāo)志物進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)果顯示，所有用于絕對(duì)定量的肽段，歸一化到重標(biāo)肽信號(hào)后，實(shí)現(xiàn)了平均 CV 為 5.1%，100% 的定量肽段 （橙色）CV 低于 20%（如論文補(bǔ)充圖 6所示），對(duì)比沒(méi)有內(nèi)標(biāo)時(shí)的波動(dòng)，顯著提升了定量的穩(wěn)定性。

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亮點(diǎn)3：

檢測(cè)限（LOD）和定量限（LOQ）符合預(yù)期，大多數(shù)肽段 LOD 和 LOQ 低于 0.1 ng ，部分甚至達(dá)到amol級(jí)別的靈敏度（如論文補(bǔ)充圖 7所示）。 

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這種性能使得研究人員能夠在短梯度分析中同時(shí)追蹤數(shù)百個(gè)肽段。以酒精相關(guān)性肝病（ALD）的血漿蛋白為例，本研究完整地演示了如何從 DIA 發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)遷移到臨床可用的 PRM/MS3 靶向檢測(cè)方法，使得部分目標(biāo)肽獲得更好的信噪比（如論文補(bǔ)充圖7所示）和LOD/LOQ，但值得一提的是不同肽的這種效果有所不同。

亮點(diǎn)4：

在這一過(guò)程中，15N重蛋白發(fā)揮了關(guān)鍵作用。作為“全長(zhǎng)蛋白內(nèi)標(biāo)”，它們與內(nèi)源蛋白經(jīng)歷完全相同的變性、還原和消化步驟，能夠真實(shí)反映實(shí)驗(yàn)全過(guò)程，從而提供高度一致的定量參考，且輕（橙色）與重（藍(lán)色）肽段在蛋白序列上的強(qiáng)度軌跡基本保持一致。（如論文補(bǔ)充圖9所示）

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總結(jié)：

通過(guò)這種方式，研究團(tuán)隊(duì)建立了一個(gè)既可擴(kuò)展、又可遷移的質(zhì)譜檢測(cè)流程，從基礎(chǔ)發(fā)現(xiàn)研究到臨床級(jí)檢測(cè)實(shí)現(xiàn)了高效的無(wú)縫銜接。這一成果不僅驗(yàn)證了 Stellar MS 的潛力，更突出了高質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在臨床蛋白質(zhì)組學(xué)中的決定性作用。

Mann教授組作為國(guó)際質(zhì)譜蛋白質(zhì)組學(xué)的團(tuán)隊(duì)，研究成果對(duì)整個(gè)領(lǐng)域具有示范意義。我們很榮幸能和他們合作評(píng)價(jià)這臺(tái)創(chuàng)新的Stellar MS以及靶標(biāo)蛋白分析流程。Stellar MS 具備優(yōu)異的靈敏度、重現(xiàn)性、穩(wěn)定性、易用性等多個(gè)優(yōu)勢(shì)，大量的單蛋白生物標(biāo)志物檢測(cè)方法有可能被取代，更傾向于采用一次進(jìn)樣中同時(shí)分析多個(gè)蛋白質(zhì)，定量濃度可從幾百ug/mL甚至到pg/mL，并能覆蓋許多在常規(guī)臨床中使用的蛋白質(zhì)標(biāo)志物。

最后值得再次強(qiáng)調(diào)的是，Stellar MS具備很多三重四極桿質(zhì)譜沒(méi)有的MS3采集方式，而且是行之有效、實(shí)用的，本研究結(jié)果表明，基于 MS3 的采集模式的確能夠進(jìn)一步降低LOD，雖然這并不適用于實(shí)驗(yàn)中所有的肽段離子（尤其是那些長(zhǎng)度低于10個(gè)氨基酸的肽段），但對(duì)于較長(zhǎng)的肽段，通常能有效地將LOD減半。因此，將 MS2 和 MS3 檢測(cè)方法結(jié)合起來(lái)，針對(duì)每個(gè)肽段選擇相應(yīng)的采集方案，這樣很可能會(huì)生成具有最佳靈敏度和特異性的靶向檢測(cè)方法，這恰恰也是Stellar MS方法設(shè)置靈敏性的又一體現(xiàn)。

生物標(biāo)志物轉(zhuǎn)化和臨床應(yīng)用的道路任重而道遠(yuǎn)，Stellar MS的橫空出世，展示出巨大的前景，可謂給廣大科研人員提供一個(gè)更強(qiáng)有力的平臺(tái)，加速研究成果的落地。

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原文：

A novel hybrid high speed mass spectrometer allows rapid translation from biomarker candidates to targeted clinical tests using 15N labeled proteins - ScienceDirect

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