什么是細胞傳代培養？ 

細胞傳代培養，也稱為細胞傳代，是指將培養基移除并將細胞從之前的培養物轉移到新鮮的生長培養基中的過程。這一程序使得細胞系或細胞株能夠進一步增殖和維持。 

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培養細胞生長模式的特征 

培養細胞時，細胞生長遵循標準模式。接種后會有一段停滯期，隨后是指數生長階段（稱為對數期）。 當貼壁培養的細胞占滿了所有可用的基質并且沒有空間繼續擴展，或者當懸浮培養的細胞超過了培養基支持進一步生長的能力時，細胞增殖會大幅減少或停止（參見下圖1）。當細胞覆蓋培養皿或細胞密度超過培養基的承載能力時，應該對細胞進行傳代或亞培養。這能讓細胞保持在最佳密度以促進持續生長，并刺激進一步的增殖。維持對數生長期的增長將盡可能增加實驗的健康細胞數量。 

圖 1：培養細胞生長模式的特征。 半對數圖形顯示了細胞培養密度對培養時間的關系。 培養基中的細胞通常以標準生長模式增殖。 細胞培養接種后的第一個生長階段是停滯期，這是細胞緩慢生長的時期，此時細胞正在適應培養環境并為快速生長做準備。 停滯期之后是對數生長期（即“對數"期），這是一個細胞呈指數增殖并消耗培養基中營養物質的時期。 當所有的培養基都被耗盡（即一種或多種營養物質已被耗盡）或者當細胞占滿了所有可用的基質時，細胞就會進入靜止期（即平臺期），在此階段，細胞的增殖會大大減少或停止。 

什么時候需要進行細胞傳代培養？ 

在貼壁培養和懸浮培養中，確定是否需要進行傳代培養的標準類似；然而，哺乳動物細胞系和昆蟲細胞系之間存在一些差異。 

哺乳動物細胞 

細胞密度：貼壁培養的細胞應在到達匯合點之前的對數生長期進行傳代。 正常細胞在到達匯合點（接觸抑制）時會停止生長，而且在重新接種后需要更長的時間才能恢復生長。 轉化細胞即使在到達匯合點后仍能繼續增殖，但通常在約兩次倍增后會開始退化。同樣，懸浮細胞應在對數生長期，在它們達到匯合狀態之前進行傳代。 達到匯合狀態時，懸浮細胞會聚集成團塊，渦旋培養瓶時，培養基會變得渾濁。 

培養基耗盡：生長培養基 pH 值下降通常表明乳酸積聚，乳酸是細胞代謝的副產物。乳酸對細胞有毒性，低 pH 值對細胞培養的環境。pH 值的變化速率通常取決于培養物中的細胞濃度，高細胞濃度下的細胞比低細胞濃度下的細胞會更快耗盡培養基。?如果觀察到隨著細胞濃度的增加，pH 值快速下降（>0.1 – 0.2 pH 單位），則應進行細胞傳代。 

昆蟲細胞 

細胞密度：昆蟲細胞應在達到匯合狀態之前的對數生長期進行傳代。 雖然緊密貼壁的昆蟲細胞可以在匯合狀態下進行傳代，這有助于更容易地從培養容器中分離，但反復在超過匯合密度的情況下傳代的昆蟲細胞會表現出增殖時間延長、存活率下降以及附著能力減弱的現象。另一方面，如果在昆蟲細胞達到匯合狀態之前進行傳代，則需要更大的機械力才能將它們從單層細胞中分離出來。當反復在未達到匯合狀態之前進行傳代時，這些細胞也會表現出增殖時間延長、存活率下降，并被認為處于不健康的狀態。 

培養基耗盡：通常在比哺乳動物細胞使用的培養基酸性更強的環境中培養昆蟲細胞。 例如，用于培養 Sf9 細胞的 TNM-FH 和 Grace 培養基的 pH 為 6.2。 與哺乳動物細胞培養不同，昆蟲細胞生長時 pH 值會逐漸升高，但通常不會超過 pH 6.4。 然而，與哺乳動物細胞一樣，當昆蟲細胞達到更高密度時，生長培養基的 pH 值將開始下降。 

細胞傳代培養時間表 

在進行細胞傳代時，嚴格遵守時間表可以確保細胞行為的可重復性，并便于監測細胞的健康狀況。 調整細胞接種密度，直到實現與細胞類型相匹配的穩定生長速率和適當的產量。 偏離已建立的生長模式通常表明細胞培養不健康（例如，退化、污染）或培養系統的某個組件未正常工作（例如，溫度不適宜、培養基過期）。 我們強烈建議您保持詳細的細胞培養記錄，列出補料和傳代的時間表、使用的培養基類型、采用的解離程序、分瓶比例、形態學觀察、接種密度、產量以及任何抗生素的使用情況。 

最好根據傳代培養時間表來進行實驗和其他非常規操作（例如，更換培養基類型）。 如果您的實驗時間表與常規的傳代培養時間表不一致，務必確保不要在細胞仍處于滯后期或已經達到匯合狀態并停止生長時進行傳代。 

推薦用于普通細胞株的培養基 

許多連續培養的哺乳動物細胞系可以在相對簡單的培養基中維持生長，例如添加血清的 MEM，而且在 MEM 中培養的細胞很可能也可以很容易地在 DMEM 或 Medium 199 中生長。 但是，當表達特異功能時就可能需要更復雜的培養基。  有關針對給定細胞類型選擇適當培養基的信息通常可在已發表的文獻中獲得也可從細胞來源處或細胞庫中獲得。 

如果關于您使用的細胞類型沒有可用的適當培養基信息，可以根據經驗選擇培養基和血清，或者測試幾種不同的培養基以獲得最佳結果。 通常，貼壁細胞培養最好從 MEM 培養基開始，懸浮細胞培養最好從 RPMI-1640 培養基開始 

通常在比哺乳動物細胞使用的培養基酸性更強的環境中培養昆蟲細胞，如 TNM-FH 和 Grace 培養基。 

貼壁細胞解離 

貼壁細胞傳代培養的第一步是通過酶解或機械方法將細胞從培養容器的表面分離下來。 下表列出了各種細胞解離程序。 

TrypLE 解離酶 

Gibco TrypLE Express 和 TrypLE Select 是微生物生產的細胞解離酶，其動力學和切割特異性與胰蛋白酶相似。 盡管 GIBCO ™ TrypLE ™ 酶可在解離過程中直接替代胰蛋白酶，無需更改方案，但我們建議您首先優化解離的孵育時間。 由于 TrypLE 酶是重組真菌胰蛋白酶樣蛋白酶，因此非常適合需要非動物源性試劑的應用。 下表將 TrypLE Express 和 TrypLE Select 與胰蛋白酶進行了比較。 

貼壁細胞傳代培養方案及步驟 

貼壁細胞培養的特點是細胞在附著于促生長基質時能夠增殖，這種特性被稱為 “錨定依賴性"。以下方案詳細介紹了從培養器皿中解離貼壁細胞以及后續傳代（或分瓶）貼壁細胞的各種方法。 

用于分離和傳代貼壁細胞的材料 

除以下目錄產品外，分離和傳代貼壁細胞還需要： 

· 貼壁細胞 

· 經組織培養處理的培養瓶、培養板或培養皿 

· 生長培養基：基礎培養基、血清和補充劑，預熱至 37°C 

· 一次性無菌 15 mL 試管 

· 37°C 培養箱，含 5% CO?的 humidified atmosphere 

· 移液管和移液管吸頭 

· 自動細胞計數器，如 Countess 自動細胞計數器 

貼壁細胞傳代培養步驟 

以下貼壁細胞培養步驟描述了哺乳動物細胞的傳代方法。請注意，昆蟲細胞的傳代步驟與哺乳動物細胞在多個關鍵環節存在差異。如需了解更多信息，請參考《貼壁昆蟲細胞傳代培養注意事項》。 

在實驗中對特定細胞系進行傳代時，建議嚴格遵循所用產品的說明書，尤其是關于培養基的配制要求。偏離特定細胞類型指定培養條件的后果可能從異常表型的表達，到細胞培養的失敗不等。賽默飛世爾科技所有產品的安全數據表（SDS）可在此處查閱。 

傳代前，確保與細胞接觸的溶液和設備均無菌。在整個傳代過程中使用正確的無菌操作，并在超凈工作臺內進行操作。 

傳代前需常規監測細胞活力。貼壁細胞應在對數生長期傳代，此時細胞活力需大于 90%。 
 

1. 從培養容器中移除并丟棄用過的細胞培養液。 

2. 使用不含鈣和鎂的平衡鹽溶液洗滌細胞（每 10 cm2 培養表面積約 2 mL）。將洗滌液輕輕加入容器中與貼壁細胞層相對的一側，避免干擾細胞層，然后前后搖晃容器數次。洗滌步驟可去除可能抑制解離試劑作用的血清、鈣和鎂殘留。 

3. 從培養容器中移除并丟棄洗滌液。 

4. 向培養瓶側壁加入預熱的解離試劑（如胰蛋白酶或 TrypLE），用量以覆蓋細胞層為宜（每 10 cm2 約 0.5 mL）。輕輕搖晃容器，確保細胞層被試劑覆蓋。 

5. 將培養容器在室溫下孵育約 2 分鐘。注意，實際孵育時間因細胞系而異。 

6. 在顯微鏡下觀察細胞是否脫落。如果脫落的細胞不足 90%，可延長孵育時間幾分鐘，每 30 秒檢查一次解離情況。也可輕敲容器以加速細胞脫落。 

7. 當≥90% 的細胞脫落時，短暫傾斜容器讓細胞聚集。加入 2 倍體積（相對于解離試劑用量）的預熱培養基，通過吸管在細胞層表面反復吹吸以分散細胞。 

8. 將細胞轉移至 15 mL 離心管，以 200×g 離心 5-10 分鐘。注意，離心速度和時間因細胞類型而異。 

9. 用少量預熱的培養基重懸細胞沉淀，并取樣計數。 

10. 使用血細胞計數板結合臺盼藍排斥法，或 Invitrogen Countess 自動細胞計數儀測定總細胞數和存活率。如有必要，向細胞中添加培養基以達到所需濃度，并重新計數。 

11. 將細胞懸液稀釋至該細胞系推薦的接種密度，將適當體積的細胞懸液移入新的培養容器，放回培養箱。如果使用培養瓶，除非是帶有透氣蓋的通氣培養瓶，否則需松開瓶蓋以保證氣體交換。 

貼壁昆蟲細胞傳代培養注意事項 

雖然昆蟲細胞傳代的一般步驟與哺乳動物細胞相同，但這兩種培養體系的一些關鍵要求存在差異。為獲得最佳結果，請始終遵循實驗中所用產品的說明書。 

貼壁昆蟲細胞的傳代時機 

昆蟲細胞應在對數生長期、未達到匯合狀態時傳代，除非是強貼壁性細胞。對于強貼壁性昆蟲細胞，可在達到匯合狀態或剛開始從培養瓶底部脫離時傳代，此時細胞更易脫落。然而，若昆蟲細胞反復在超過匯合密度時傳代，會出現倍增時間延長、存活率下降和貼壁能力減弱的情況。 

相反，在貼壁培養中，若昆蟲細胞在未達到匯合狀態時傳代，需要更大的機械力才能使其從單層上脫落。若反復在未匯合時傳代，細胞也會出現倍增時間延長、存活率下降的不健康狀態。匯合度低于 20% 同樣會抑制細胞生長。 

昆蟲細胞的傳代培養方法 

· 昆蟲細胞需在 27°C、非 humidified 環境中培養。細胞可在室溫下避光放置于桌面或抽屜中，但建議使用 27°C 的恒溫環境。 

· 昆蟲細胞培養不建議進行 CO?交換。 

· 使用專為昆蟲細胞生長配制的培養基。昆蟲細胞培養基通常比哺乳動物細胞培養基更偏酸性（如 Grace 培養基）。如需了解更多關于昆蟲細胞培養基的信息，請訪問 “細胞培養環境"。 

· 在無血清條件下，昆蟲細胞與基質的貼附非常緊密，需要額外操作才能使其脫落。可通過快速抖動手腕搖晃培養瓶來輔助脫落。為避免污染，操作前需擰緊瓶蓋。 

· 切勿劇烈搖晃培養瓶，否則可能損傷細胞。 

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