基質效應(matrix effect/ matrix interference)是指樣品中的其他物質可能對檢測目標分析物的能力產生影響，在對生物樣品如血清、血漿、組織勻漿等的免疫檢測中最為常見，因為這類樣品中的許多成分如碳水化合物、蛋白質、磷脂、代謝物等會干擾抗體與其目標的結合，或抑制或增強信號，影響分析物的準確定量[1]。
 

　　在臨床研究的生物分析中，基質干擾更是一個巨大的挑戰，例如在血清和血漿中已經發現了多種類型的干擾，通常是內源性物質如類風濕因子、嗜異性抗體(針對不明確的抗原產生的抗體，呈現低親和力和弱結合)、人抗動物抗體(HAAA,當免疫系統與動物抗體接觸時產生的高親和力抗體)以及其他血漿蛋白，如白蛋白、溶菌酶、纖維蛋白原等[2]，這些干擾因素直接影響檢測的靈敏度、特異性和變異性，導致分析物定量不準確。
 

　　減少基質效應的最基本方法是樣品稀釋，但前提是稀釋后分析物的水平仍在線性范圍內，而且稀釋會影響檢測靈敏度，所以并非通用的策略。優化緩沖液pH和離子強度也有助于減少非特異性相互作用。其他克服干擾的策略包括加入與干擾分子結合或競爭的物質，如用適當的動物血清雞尾酒來被動去除人類抗鼠抗體(HAMA)，使用嗜異性抗體抑制劑如嗜異性阻斷試劑(HBR)和免疫球蛋白抑制試劑(IIR)、或使用缺乏Fc片段的F(ab′)2或單鏈片段(scFv)作為捕獲/檢測試劑等[3]，然而這些方法大多數都是勞動密集型的且價格昂貴，對于大樣本量的研究并不實用。
 

　　對于基于配體結合試驗(ligand binding assay, LBA)的免疫檢測，減少孵育時間或檢測試劑與基質接觸的時間已被證明是克服基質效應的有效手段之一[4]。Gyrolab®在微流控的CD上實現親和柱流穿模式，從而最大限度地減少了試劑與基質的接觸時間，將基質干擾最小化。Bristol-Myers Squibb公司的Shannon D Chilewski等人[5]利用Gyrolab®平臺解決了臨床前PK研究中的基質干擾問題。
 

 

　　該案例是在對某一PEG化抗體的PK檢測中觀察到了來源于人抗動物抗體(HAAA)的基質干擾。在藥物發現階段，用于支持單次給藥劑量遞增(single ascending dose，SDA)研究的檢測方法是基于電化學發光檢測(ECL)的方法，以靶點分子為捕獲試劑，山羊抗Vk抗體為檢測試劑，樣品稀釋度為50倍，定量下限LLOQ為80ng/mL。
 

　　但當從發現階段過渡到開發階段時，要求更低的檢測靈敏度并同時保持或提高準確性和精確度，而且因為以下三個原因，ECL檢測方法80ng/mL的LLOQ已不適合支持下一階段的研究：
 

　　1 開發團隊對該藥物在較低劑量下的半衰期特征感興趣，如果沿用目前的檢測方法，結果會

　　2 希望在受體占有率EC50為78ng/mL時測量循環中的藥物濃度；
 

　　3 在出現免疫原性的情況下，抗藥抗體可能對藥物有清除作用，降低循環中的藥物水平，所以推斷該檢測方法對較低劑量下的藥物定量會進一步受限。
 

　　為了提高檢測靈敏度，將LLOQ拓展至所要求的30ng/mL，研究團隊探索了采用Gyrolab®平臺和新試劑組合，在有限的時間內快速開發新的檢測方法。

 

 

　　首先在Gyrolab®上對捕獲和檢測試劑組合進行了篩選，以山羊多克隆抗藥抗體作為捕獲試劑，小鼠抗特別型單抗作為檢測試劑，這一組合顯示出最佳性能，捕獲抗體濃度為100µg/mL，檢測抗體濃度為2500ng/mL。使用Gyrolab® Bioaffy 200 CD(樣品體積200nL)和標準的Gyrolab®三步法(捕獲-分析物-檢測)進行分析,  樣品稀釋MRD為2。

 

 

　　PBS-T作為稀釋緩沖液(PBS + 1% BSA + 0.05% Tween-20)，樣品稀釋2倍。在3天內進行了6次CD測試。每張CD包括一條標準曲線和6個級別QC樣品的4個重復。標準曲線范圍為30-2000ng/mL，錨點為2500ng/mL。QC樣品在100%人血清中稀釋125倍，然后用檢測緩沖液稀釋2倍，以使濃度落在測定范圍內。表1顯示所有結果都有良好的檢測準確度和精確度。
 

 

 

　　分別用PBS-T緩沖液和Gyros專利的Rexxip H緩沖液(Gyros)稀釋樣品進行平行比較。 由于檢測方法中含有小鼠單抗，人抗鼠抗體HAMA是潛在干擾源，而Rexxip H緩沖液含有中和嗜異性抗體的成分，所以使用Rexxip H稀釋后應能抑制基質干擾信號。
 

　　20個血清樣本(10個正常人的血清NHS1-10，10個患病人群的血清DPS1-10)以30ng/mL的LLOQ濃度摻入藥物進行分析，所有20個樣本也都進行了未加標的分析。驗收標準：80%的加標樣品需要在標稱濃度±25%的偏差范圍內回收，所有未加標樣品的回收必須低于LLOQ。結果(表2)顯示，正常人血清樣本使用Rexxip H緩沖液稀釋后符合目標接受標準。正常人血清2號樣品，使用PBS-T的回收率為252.6%，使用Rexxip H的回收率在25%以內，說明Rexxip H緩沖液非常好的消除了該樣本中的基質干擾。其中兩個疾病血清樣本在未加標樣時，即使使用Rexxip H緩沖液，其反算濃度為32~35ng/mL。因此，在對疾病人群的研究設計中，必須重復加標實驗，將LLOQ設計為40ng/mL。
 

 

　　將電化學發光(ECL)檢測方法(LLOQ 80ng/mL)轉移到了Gyrolab®平臺上，使用優化后的抗體對和緩沖液，產生了靈敏度更高的檢測結果，將LLOQ改進至30ng/mL,  可以滿足未來研究的要求。
 

　　Gyrolab® 平臺的親和柱流穿模式以及專利的Rexxip 緩沖液可以最大程度的降低基質效應造成的數據準確度和靈敏度的下降。
 

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　　參考文獻：
 

　　[1]. Selby C. Interference in immunoassay. Ann. Clin. Biochem. 36(Pt 6), 704–721 (1999).
 

　　[2]. Ana I. Barbosa, Nuno M. Reis. Antibody Surface Coverage Drives Matrix Interference in Microfluidic Capillary Immunoassays. ACS Sensors 2021 6 (7), 2682-2690.
 

　　[3]. Williams K, Erickson R, Fischer SK. Overcoming disease-specific matrix effect in a clinical pharmacokinetic assay using a microfluidic immunoassay technology. Bioanalysis, 9(16), 1207–1216 (2017).
 

　　[4]. Saloumeh K. Fischer. Ligand binding assay technologies: matching the right tool to your bioanalytical challenge. https://www.bioanalysis-zone.com.
 

　　[5]. Shannon D Chilewski. Addressing matrix effects in ligand-binding assays through the use of new reagents and technology.Bioanalysis (2014) 6(8), 1059–1067.