一、分離系統:陽離子交換色譜柱的核心作用
氨基酸分析儀的分離系統以陽離子交換樹脂柱為核心,通過離子交換與pH梯度洗脫實現氨基酸的精準分離。樹脂表面磺酸基團(-SO??)與氨基酸的氨基(+H?N-CHR-COOH)發生靜電吸附,不同氨基酸因電荷密度、分子大小及極性差異,與樹脂的親和力不同。洗脫過程中,通過調節流動相(如檸檬酸鈉或檸檬酸鋰緩沖液)的pH值(通常從2.8逐步升至4.8)和離子強度,氨基酸按親和力由弱到強的順序依次釋放,實現基線分離。例如,酸性氨基酸(如谷氨酸)因羧基電離程度高,最先被洗脫;堿性氨基酸(如賴氨酸)則因氨基電離強,最后洗脫。分離系統通常配備恒溫套管(如53℃水?。?,以穩定樹脂交換容量,確保重復性。
二、反應系統:柱后衍生增強檢測靈敏度
分離后的氨基酸需通過柱后衍生反應轉化為可檢測的有色化合物。主流方法采用茚三酮試劑,在115-130℃高溫下與氨基酸反應:
伯胺型氨基酸(如丙氨酸):生成藍紫色化合物(λ=570nm);
仲胺型氨基酸(如脯氨酸):生成黃色化合物(λ=440nm)。
反應系統通過高溫反應螺管(如16米聚四氟乙烯管)延長反應時間,確保衍生。部分儀器(如賽里安Artemis6000)采用雙試劑泵設計,分別輸送茚三酮與緩沖液,避免試劑降解,同時通過氮氣保護防止茚三酮氧化,提升反應穩定性。
三、檢測系統:雙波長光度法實現精準定量
檢測系統采用雙通道可見光光度計,在570nm和440nm波長下同步檢測衍生產物的吸光度。根據朗伯-比爾定律,吸光度與氨基酸濃度呈線性關系,儀器通過峰面積積分計算含量。例如,日立L-8800型儀器配備微型高精度二極管陣列檢測器,靈敏度可達3-50pmol,峰面積重現性RSD≤1%。檢測系統還集成在線脫氣裝置,消除流動相氣泡干擾,并配備標準曲線自動校正功能,支持20種以上氨基酸的同步定量分析,廣泛應用于食品營養評估、臨床疾病診斷及生物制藥質量控制。
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