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生物傳感器“探路”，大腸桿菌 L-蘇氨酸產(chǎn)量提升
L-蘇氨酸作為必需氨基酸，在飼料、食品和醫(yī)藥領(lǐng)域需求旺盛。系統(tǒng)代謝工程雖已使大腸桿菌生產(chǎn) L-蘇氨酸效價突破 120 g/L，卻因代謝網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜、靶點難尋而難以兼顧效價與產(chǎn)率。因此，需要創(chuàng)新及高效的方法來加速菌株進化。
“Combining biosensor and metabolic network optimization strategies for enhanced l?threonine production in Escherichia coli”是 2025 年 3 月江南大學(xué)饒志明團隊發(fā)表在 Biotechnology for Biofuels and Bioproducts 上的一篇文章。該研究提出了一系列工程策略，以進一步提高 L-蘇氨酸生產(chǎn)菌的產(chǎn)能。
首先，利用轉(zhuǎn)錄組分析篩選在大腸桿菌中能夠感應(yīng)外源 L-蘇氨酸的啟動子。
隨后，通過將 CysB 突變體與 eGFP 相結(jié)合，構(gòu)建了能夠靈敏響應(yīng) L-蘇氨酸濃度變化的熒光報告系統(tǒng)。
接著，利用該生物傳感器輔助 FACS 和 QPix 兩步高通量篩選技術(shù)，實現(xiàn)菌株的迭代進化，以捕獲優(yōu)良突變體。
進一步地，通過多組學(xué)分析鑒定有益靶點，并借助 GSMN 優(yōu)化胞內(nèi)碳通量分配，以最大化 L-蘇氨酸產(chǎn)量。
本研究不僅開發(fā)出一株具有工業(yè)應(yīng)用潛力的 L-蘇氨酸高產(chǎn)菌株，還展示了構(gòu)建高靈敏度 L-蘇氨酸生物傳感器的新方法，為開發(fā)針對其他化學(xué)品的生物傳感器提供了新的思路。
圖 1：流程概覽
Results and Discussion
結(jié)果與討論
篩選響應(yīng) L-蘇氨酸濃度變化的內(nèi)源遺傳元件
為開發(fā)高靈敏 L-蘇氨酸生物傳感器，研究者先對 MG1655 施加 0–60 g/L 外源蘇氨酸并進行轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，篩得 32 個表達(dá)量與蘇氨酸正相關(guān)的基因；進一步聚焦 21 個啟動子構(gòu)建 eGFP 報告文庫后，確認(rèn) PcysK 響應(yīng)最佳并呈線性，但天然元件閾值窄、假陽性高，需后續(xù)優(yōu)化。
圖 2：L-蘇氨酸生物傳感器的挖掘、設(shè)計與表征
改造傳感器以提高對 L-蘇氨酸的響應(yīng)
為克服天然傳感器靈敏度低、閾值窄的缺陷，研究對“cys”系列啟動子進行人工改造：
刪除 CysB 結(jié)合位點后，L-蘇氨酸響應(yīng)完全消失，證實 CysB 是必需調(diào)控因子。
隨后，在靈敏度更高的 pTrc99A-PcysK-egfp 質(zhì)粒中過表達(dá) CysB，構(gòu)建“pSensor，其線性區(qū)間被壓縮至 0–4 g/L，靈敏度提高 2.1 倍。
分子對接和定點突變鎖定 CysB-T102 為關(guān)鍵位點，T102A 突變體“pSensorThr”響應(yīng)閾值再升 2.4 倍，且能可靠區(qū)分高產(chǎn)（THR36-L19）與無產(chǎn)（THR01）菌株。
與現(xiàn)有系統(tǒng)相比，pSensorThr 誤篩風(fēng)險低但響應(yīng)范圍仍窄，需進一步優(yōu)化響應(yīng)范圍以擴大適用性。
圖 3：L-蘇氨酸生物傳感器的開發(fā)、測試與優(yōu)化
圖 4：pSensorThr 生物傳感器的開發(fā)
高通量篩選輔助鑒定 L-蘇氨酸高產(chǎn)菌株
將溫度敏感突變質(zhì)粒 MP6ts 導(dǎo)入 THR36-L19，在 30 °C 誘變、42 °C 去質(zhì)粒，快速構(gòu)建大規(guī)模突變文庫；隨后引入 pSensorThr 并用 FACS、QPix 高通量篩選設(shè)備進行 5 輪“突變-篩選”循環(huán)，共挑出 50 株高產(chǎn)熒光突變株。搖瓶驗證顯示多數(shù)菌株產(chǎn)量優(yōu)于出發(fā)菌，其中 THRM1 產(chǎn)量最高，達(dá) 38.97 g/L。
圖 5：pSensorThr 生物傳感器的應(yīng)用
QPix 在菌株篩選中起到了挑菌標(biāo)準(zhǔn)化/解放手工/高效挑菌的作用。
多組學(xué)指導(dǎo)的逆向代謝工程進一步提升 L-蘇氨酸產(chǎn)量
THRM1 高產(chǎn)源于“Tpx C61G”與“SpoT R290H→H290R 回復(fù)”兩突變：產(chǎn)率提升≈3%。此外，敲除 tpx 或 spoT 分別微增或嚴(yán)重降產(chǎn)，證實二者作用。其余 4 個突變無顯著貢獻(xiàn)。轉(zhuǎn)錄組顯示 THRM1 重調(diào)碳流：EMP 與乙醛酸途徑上調(diào)、TCA 下調(diào)，pps 高表達(dá)補充 PEP；但 pykF、poxB、pflB 過表達(dá)造成碳流失。依次敲除這三基因，THRM6 產(chǎn)量升至 41.36 g/L。這些發(fā)現(xiàn)明確了關(guān)鍵遺傳靶點，也為后續(xù)進一步提升產(chǎn)量提供了方向。
圖 6：基于多組學(xué)分析的逆向代謝工程解析 L-蘇氨酸高產(chǎn)機制
圖 7：計算機模擬預(yù)測新的代謝工程靶點
Summary
總結(jié)
本研究開發(fā)了一種高靈敏度、高熒光閾值的生物傳感器，并用于高通量平臺篩選優(yōu)異突變株。通過多組學(xué)分析指導(dǎo)的逆向代謝工程和計算機模擬，使工程菌株 THRM13 在 5 L 發(fā)酵罐中達(dá)到 163.2 g/L 的 L-蘇氨酸產(chǎn)量，糖酸轉(zhuǎn)化率為 60.3%，為迄今在不使用外源誘導(dǎo)劑和抗生素條件下報道的最高水平。此外，該高通量篩選策略仍可繼續(xù)用于菌株的后續(xù)迭代進化。
QPix FLEX 微生物克隆篩選系統(tǒng)
參考文獻(xiàn)
Zhenqiang Zhao1,2?, Rongshuai Zhu1,2?, Xuanping Shi1,2, Fengyu Yang1,2, Meijuan Xu1,2, Minglong Shao1,2,Rongzhen Zhang1, Youxi Zhao3, Jiajia You1,2* and Zhiming Rao1,2*.Combining biosensor and metabolic network optimization strategies for enhanced l?threonine production in Escherichia coli. Biotechnology for Biofuels and Bioproducts.2025; 18:37.
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