Shear Stress Regulates Osteogenic Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells via the p38 Pathway

Keywords: human dental pulp stem cells, shear stress, osteogenesis

再生骨療法在牙科的種植體植入和美觀治療中應用廣泛，但拔牙后的牙槽嵴吸收及移植物吸收等問題仍待解決，且現有方法受個體條件限制。基于干細胞的組織工程是牙槽骨增量的重要替代方案，其中間充質干細胞與間充質基質細胞（MSCs）可分化為多種功能細胞，存在于多種組織中。人牙髓干細胞（hDPSCs）具備多能性，可從恒牙的牙髓組織中獲取，在牙本質和骨形成方面有潛力，是高效牙槽骨增量的潛在來源。此外，機械刺激能促進干細胞骨分化，有研究顯示剪切應力對源自 hDPSCs 的成骨樣細胞有影響，hDPSCs 在礦化條件下會對脈動流體剪切應力產生響應。

hDPSCs 對機械刺激高度敏感，多種機械刺激可調控其增殖與成骨分化。低強度脈沖超聲（LIPUS）能誘導其增殖，周期性機械張力可提升成骨標志物表達，脈動液流（PFF）、靜態拉伸應變及微納米拓撲結構等則通過提高 NO、PGE2、COX-2 水平增強成骨活性，且這些過程多由 Piezo-1/2 蛋白等機械敏感通道經 ERK 1/2 MAPK 信號通路介導。不過，剪切應力雖能促進其他骨相關細胞的成骨分化，但其誘導 hDPSCs 成骨分化的機制尚未明確。

基于此，泰國朱拉隆功大學牙科學院的團隊為了探究剪切應力對 hDPSCs 成骨分化的影響及潛在機制，提出了特定剪切應力可增強 hDPSCs 成骨分化的假設。研究成果發表在International journal of molecular sciences 雜志，題為“Shear Stress Regulates Osteogenic Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells via the p38 Pathway"。

首先，為了評估剪切應力在 hDPSCs 成骨分化中的作用，研究人員在施加剪切應力 24 小時后，將 hDPSCs 在成骨培養基（OM）中額外培養 21 天。結果顯示，剪切應力可顯著上調不同培養階段（7 天、14 天、21 天）的成骨相關基因（如 RUNX2、OSX、ALP、COL1A1、OCN、OPN）表達（圖 1A），且 14 天時成骨細胞特異性轉錄因子（OSX）的蛋白表達在剪切應力組中顯著高于靜態對照組（圖 1B-D），而普通生長培養基（GM）中的靜態培養組未檢測到 OSX 表達（圖 1B）。這表明剪切應力能促進 hDPSCs 的成骨分化。

圖1     施加剪切應力可促進 hDPSCs 的成骨分化。

接著，研究人員為了探究剪切應力對成骨誘導的 hDPSCs 礦化過程的作用，通過在成骨誘導的第 7、14、21 天采用 ALP 染色和 ARS 染色進行檢測。結果發現，作為早期成骨標志物的 ALP，其染色強度在剪切應力組的第 14 和 21 天顯著增強（圖 2A）。靜態對照組的細胞生長區域雖有礦化，但剪切應力組在第 14 和 21 天的礦化程度更明顯（圖 2B），且 ARS 染色的定量結果證實，剪切應力可顯著促進成骨誘導的 hDPSCs 礦化（圖 2C）。這表明剪切應力能推動成骨誘導的 hDPSCs 發生礦化。

圖2     剪切應力促進了 hDPSCs 的堿性磷酸酶活性及礦化作用。

接下來，研究人員通過 RNA 測序等方法探究了剪切應力作用后 hDPSCs 成骨分化相關的信號通路。結果顯示，剪切應力處理使 19 個基因上調、26 個基因下調（圖 3A）。其中 CCAAT 增強子結合蛋白 δ（CEBPD）的表達被顯著上調（圖 3B-C）。KEGG 通路富集分析表明 MAPK 信號通路參與了該過程，涉及 11 個上調和 7 個下調的差異表達基因（圖 3D）。

圖3     施加剪切應力 24 h后 hDPSCs 的 DEGs 鑒定。

最后，研究人員探究了剪切應力誘導 hDPSCs 成骨分化的具體機制。在施加應力前，先用 p38 抑制劑（SB203580）處理 hDPSCs，隨后施加剪切應力，再將細胞在成骨誘導培養基中培養 21 天。結果發現，剪切應力可上調成骨標志物基因（RUNX2、OSX、ALP、COL1A1 ）的 mRNA 表達（圖 4A），并增強細胞礦化與鈣化。而 p38 抑制劑能顯著阻斷上述成骨標志物基因在 14 天和 21 天的上調（圖 4A），同時降低 14 天（圖 4B）和 21 天（圖 4C）的礦化與鈣化程度。這表明剪切應力是通過 p38 MAPK 通路刺激 hDPSCs 成骨分化的。

圖4    p38 信號通路與 hDPSCs 中剪切應力誘導的成骨分化相關。

圖5     p38 MAPK 通路參與剪切應力增強 hDPSCs 成骨分化的機制示意。  

總之，該研究表明了剪切應力可以通過p38 MAPK信號通路增強hDPSC的成骨分化（圖5）。這些研究的結果有可能帶來改善骨骼修復和再生的創新方法。

參考文獻：Lwin HY, Tiskratok W, Kyawsoewin M, Manokawinchoke J, Termkwanchareon C, Limjeerajarus N, Limjeerajarus CN, Egusa H, Osathanon T, Limraksasin P. Shear Stress Regulates Osteogenic Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells via the p38 Pathway. Int J Mol Sci. 2025 Jun 13;26(12):5667. doi: 10.3390/ijms26125667. PMID: 40565131; PMCID: PMC12193168.

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