循環腫瘤DNA（ctDNA）作為癌癥早期診斷和動態監測的關鍵生物標志物，其超靈敏檢測面臨核心挑戰。早期患者ctDNA突變等位基因頻率（VAF）常低于0.1%，而傳統組織活檢因侵入性風險、腫瘤異質性及樣本可及性限制難以滿足實時監測需求?，F有高靈敏度技術如液滴數字PCR（ddPCR）和二代測序（NGS）雖可檢測低豐度突變，但前者依賴熱循環儀與復雜設備，后者需繁瑣的文庫構建和生物信息學分析，且成本高昂，難以適配床旁檢測場景。等溫擴增技術雖規避了熱循環限制，卻易受非特異性擴增干擾，制約檢測準確性。

CRISPR/Cas系統憑借高特異性靶向能力為分子診斷帶來突破，其中Cas14a因其最小化結構、單鏈DNA特異性切割及無需PAM序列的特性，展現出優于Cas12a的識別穩定性。然而，CRISPR直接檢測靈敏度通常僅達皮摩爾級，難以滿足早期癌癥ctDNA檢測需求。研究通過創新性整合RPA擴增與CRISPR/Cas14a系統，利用二者最適溫度匹配的特性，構建雙重優化機制，RPA實現目標指數富集提升靈敏度，Cas14a特異性切割消除非特異背景信號，為超靈敏檢測奠定基礎。

乳腺癌全球年新發病例超230萬，PIK3CA H1047R突變通過組成性激活PI3Kα通路驅動內分泌治療耐藥，其早期檢測對改善預后至關重要。基于此，哈爾濱醫科大學附屬腫瘤醫院乳腺外科龐達、張顯玉團隊在這項研究中，通過T7酶選擇性消化RPA擴增產物反義鏈，實現無熱循環的ssDNA轉化；進一步采用工程化crRNA設計合成單核苷酸錯配，將CRISPR/Cas14a單堿基分辨率應用于PIK3CA H1047R突變特異性識別，在32例臨床樣本中實現與ddPCR相當的100%敏感性與特異性，且檢測限達0.01%。該系統結合數字微流控芯片，可在37℃下60分鐘內完成檢測，為精準腫瘤學提供可擴展的床旁診斷平臺。研究成果發表于“Advanced science"期刊，題為“Engineered crRNA Drives RPA-T7-CRISPR/Cas14a Cascade for Ultrasensitive Detection of ctDNA PIK3CA H1047R"。

首先，為了滿足ctDNA中SNP的超靈敏檢測，研究人員開發了TIDE-Cas14a系統。從血漿提取的ctDNA直接加入包含RPA擴增試劑、T7外切酶、Cas14a蛋白及工程化crRNA的預混體系。先將RPA在37℃等溫條件下對目標序列進行指數級擴增，生成雙鏈DNA（dsDNA）產物；隨后，T7外切酶特異性降解磷酸化修飾的反義鏈，保留PT修飾的正義鏈，完成無需熱循環的ssDNA轉化。關鍵在于crRNA的合成錯配設計，通過在非種子區引入單核苷酸取代，顯著增強Cas14a/crRNA-ssDNA復合物對靶標結合的特異性，即使野生型與突變序列同源性超99.9%，系統仍能精準識別PIK3CA H1047R等單堿基變異。靶標結合觸發Cas14a的側切活性，切割ssDNA熒光探針，釋放可實時檢測的熒光信號。進一步結合數字微流控芯片技術，將反應體系分割為10^5個納米級液滴進行并行檢測，通過熒光顯微鏡定量陽性信號比例，使靈敏度提升至attomolar級別，檢測全程在60分鐘內完成，且與ddPCR相比展現出100%的臨床符合率。

圖1    TIDE-Cas14a系統的工作流程

然后，為提升PIK3CA H1047R突變檢測特異性，研究人員將合成錯配策略應用于Cas14a系統。基于Cas14a對種子區堿基高度敏感的特性，通過系統引入單核苷酸錯配優化crRNA設計（圖2B）。在SNP位點上下游7個位置構建六種crRNA變體，實驗發現+1或+3位點引入錯配可顯著增強突變體/野生型區分能力（圖2D-I）。其中+1位點錯配crRNA使信噪比提升三倍，被選為PIK3CA檢測zuiyou方案。

圖2    通過對crRNA進行工程化改造以提高信噪比

為了驗證該策略的實用型，進一步驗證于肺癌和結直腸癌關鍵驅動突變。研究人員采用了相同的crRNA設計原理，在肺和結直腸癌中進行關鍵的致癌突變，包括EGFR T790M、EGFR L858R、BRAF V600E及KRAS G12V，均實現單堿基分辨（圖3B/D/F/H）。分子對接模擬顯示含錯配crRNA的三元復合物結合野生型DNA時對接評分顯著降低，表明其結合能下降。尤其對于EGFR L858R，原始crRNA與錯配crRNA-2均能有效區分突變，與對接評分未顯著變化的現象一致，證實錯配設計通過破壞Cas14a與野生型序列的親和力提升特異性。

圖3    工程化crRNA實現了對臨床相關致癌突變的特異性檢測

接著，研究人員通過系統篩選PIK3CA H1047R擴增引物，確定F1R1引物對在39℃/20分鐘條件下可實現高效特異性擴增（圖4C-E）。將RPA擴增與T7-CRISPR/Cas14a檢測整合為單管反應體系，經兩步法預驗證可行性后，重點優化關鍵組分參數，Cas14a與sgRNA以1:1比例協同作用時熒光信號zuiqiang，同時探針濃度優化至625 nM以平衡信噪比（圖4G-I）；T7外切酶濃度≥2.5 U/μL即可完成鏈轉換，且不產生背景噪聲（圖4J）；37℃恒溫反應60分鐘實現檢測全程閉環（圖4K）。最終確立zuiyou體系包含480 nM RPA引物、625 nM Cas14a/sgRNA復合物、625 nM ssDNA探針及2.5 U/μL T7酶。功能驗證實驗表明，僅當目標ctDNA（1 ng/μL）激活完整反應體系時，Cas14a的側切活性可特異性切割FAM-BHQ1探針釋放熒光，證實目標依賴的信號放大機制。該優化方案使檢測限達0.01%，為后續臨床驗證奠定技術基礎。

圖4    TIDE-Cas14a系統的建立與優化

為了評估用于核酸分析TIDE-Cas14a系統的定量能力和適用性，研究人員通過細胞系gDNA梯度稀釋實驗證實其檢測限（LOD）達0.01% VAF（圖5C-E）。在模擬生理條件下，系統對PIK3CA H1047R突變表現出優異定量能力。ΔF與VAF對數值線性相關，且微流控芯片在0.001% VAF時仍可檢測單分子信號（圖5C）。特異性驗證顯示系統可精準區分突變亞型，無交叉反應（圖5G），有效規避腫瘤異質性干擾。與金標準ddPCR的對比實驗采用相同樣本。ddPCR的檢測閾值為0.1% VAF，而TIDE-Cas14a在0.01% VAF仍穩定檢出，靈敏度提升10倍（圖5I）。重復性驗證涵蓋不同操作者、試劑批次及實驗日期，熒光信號變異系數<5%，證實系統具備臨床診斷級穩定性。

圖5    TIDE-Cas14a系統在檢測細胞系基因組DNA中PIK3CA H1047R突變的性能分析

接下來，為了評估TIDE-Cas14a系統在臨床實踐中的敏感特異性，研究人員收集了來自32例乳腺癌患者的組織與血漿樣本，TIDE-Cas14a系統展現出zhuoyue性能，與組織ddPCR結果相比，檢測敏感性與特異性均達100%（圖6C）；血漿ctDNA檢測中，系統檢出率顯著優于ddPCR，成功捕獲ddPCR漏診的2例IA期患者的微弱突變信號（圖6D-E）；對低豐度ctDNA的檢出能力，證實其在早期腫瘤及微小殘留病灶監測中的潛力。

圖6    使用TIDE-Cas14a系統和ddPCR在臨床樣本中檢測PIK3CA H1047R突變

最后，研究人員將TIDE-Cas14a系統與自研數字微流體芯片整合，構建可定量檢測血漿PIK3CA H1047R突變的微流控平臺（圖7A-C）。芯片采用三層結構設計，上下玻璃層與含10^5微腔陣列的PDMS芯片體，通過虹吸效應實現檢測液快速填充，避免堵塞風險。微腔密度較傳統數字PCR提升兩個數量級，顯著增強稀有突變信號捕獲能力。臨床驗證中，芯片基于熒光強度半定量分級策略，在32例乳腺癌樣本中與常規TIDE-Cas14a檢測結果高度一致，精準識別5例陽性樣本（圖7C）。雖暫未實現絕對定量，但其在>95%野生型背景下的突變識別能力已有所突破。該系統通過微腔并行反應將靈敏度推升至單分子級，且芯片制造采用可規?；腜DMS復制成型工藝，成本較商用數字PCR降低80%。該技術為腫瘤突變篩查提供兼具超靈敏、低成本特性的床旁診斷新方案。

圖7    TIDE-Cas14a系統與數字微流控芯片的聯用

總之，研究開發的TIDE-Cas14a平臺通過三重創新突破液體活檢瓶頸，融合RPA等溫擴增、T7外切酶鏈轉換及CRISPR/Cas14a特異性切割，37℃恒溫1小時內完成檢測；在crRNA特定位置引入G/C堿基錯配，實現單堿基分辨率，靈敏度較ddPCR提升10倍；集成10萬微腔陣列，單分子檢測能力達0.001% VAF，成本降低80%。臨床驗證顯示，32例乳腺癌樣本中與組織活檢一致性達100%，并成功檢出ddPCR遺漏的早期患者。該系統突破傳統方法在低豐度突變檢測中的局限，支持PIK3CA、EGFR等關鍵驅動基因分析，為早期癌癥診斷、MRD監測提供床旁解決方案。

參考文獻：Y. Yu, M. Jin, W. Yuan, et al. “ Engineered crRNA Drives RPA-T7-CRISPR/Cas14a Cascade for Ultrasensitive Detection of ctDNA PIK3CA H1047R." Adv. Sci. (2025): e07126.

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