動物性產品中獸藥殘留的快速檢測方法
—— ELISA & CharmⅡ
一、前言：
1、 現(xiàn)狀
目前獸醫(yī)用藥幾乎占據(jù)了所有抗微生物藥物的50%，因此食品病原菌、條件致病菌和共生菌不可避免的成了耐藥菌。在過去的50年中大約有100萬噸的抗生素被釋放到生物圈中。歐洲動物衛(wèi)生聯(lián)盟（European Federation of Animal Health ，F(xiàn)EDESA）對歐盟和瑞士抗生素使用統(tǒng)計數(shù)據(jù)表明，僅1997年用于人類健康的抗生素達5460噸，用于動物健康的抗生素達3465噸，用于動物生長促進劑的抗生素達1575噸，并有逐年增加的趨勢。
在我國，由于獸醫(yī)用藥制度的不完善及一些養(yǎng)殖廠受經濟利益的驅使及相應的檢測監(jiān)督體系不健全，藥物的濫用現(xiàn)象更為嚴重，動物產品中獸藥的污染時有發(fā)生。其潛在的致癌、致畸作用引起了社會的普遍關注，由于水產品中氯霉素含量過高，歐盟委員會于今年1月作出禁止中國動物源食品進口的協(xié)議，使得我國水產品對歐盟出口嚴重受挫，雖然現(xiàn)在部分產品開始解禁，但形式依然不容樂觀；美國、日本等國也開始高度關注我國水產品的質量，并出臺一系列相關政策，對我國出口動物性產品進行限制。在現(xiàn)代文明的世界，健康*的貿易法則將是關稅、價格、質量所不可比擬的，政治上的友好往來無法替代經濟貿易中的游戲規(guī)則。
2、食品中獸藥殘留對人類的危害
2.1耐藥菌株的產生
抗生素使用和細菌耐藥性永遠是互相依存、互相制約的矛盾的兩個方面，細菌耐藥非正常增加，往往是抗生素的非正常使用的結果。早在1920-30年青霉素問世時，Dr Fleming就提出了青霉素的耐藥性問題。隨著時代的發(fā)展和各種新藥的出現(xiàn)，耐藥性菌株也接踵而至（即包括藥物選擇壓力的結果也包括細菌自身的進化）。抗生素的副作用以及耐藥菌株的存在將嚴重威脅著人類的健康，而且臨床亞治療水平的抗生素更容易促使抗性基因的轉移，比如對動物進行低水平四環(huán)素治療，其糞腸菌群由對四環(huán)素敏感逐漸變成抗四環(huán)素zui后發(fā)展成對其它藥物也產生抗性。在長期的生活中，恰恰是人類和動物腸道的正常菌群成了耐藥基因的儲存庫，并不斷的將耐藥基因轉移給致病菌，并在人和動物中交叉?zhèn)鞑ィ绕涫轻尫诺江h(huán)境中耐藥菌的危害更為嚴重，可造成耐藥基因的迅速轉移。
2.2抗生素的毒副作用
殘留在動物性食品中的抗生素被人們食用后，除了加速人體內耐藥菌株的進化之外，抗生素本身的毒副作用往往威脅人類尤其是孕婦和嬰兒的健康，這一點在過去往往很容易被忽視。
2.2.1氯霉素
主要由Streptomyces venezuelae產生，目前已能人工合成。它能抑制細菌蛋白質生物合成，其效應部位位于核糖體上，因而對大多數(shù)G+菌和G－菌都有殺傷力。氯霉素的毒副作用較多，其常見的是再生障礙貧血、造血功能紊亂、灰嬰綜合征、肢體感覺和運動障礙及休克。雖然氯霉素在動物疾病防治上曾發(fā)揮過一定的作用，但由于氯霉素可以產生致命性的副作用，因此歐盟已經在畜牧、水產業(yè)生產中禁止使用。
2.2.2b－內酰胺
b－內酰胺類抗生素通過抑制細菌轉肽酶的活性而干擾細胞壁肽聚糖的合成，安芐青霉素和青霉素G是該類zui常見的兩種化合物，由Penicillium chrysogenum產生。它可以通過胎盤傳給胎兒，也能通過乳腺進入乳中。zui常見的副作用是以皮膚出現(xiàn)紅斑為主要癥狀的過敏反應以及胃腸道紊亂引起的腹瀉、惡心和嘔吐。
2.2.3四環(huán)素
包括Oxytetracycline （土霉素，OTC）、tetracycline （四環(huán)素，TC）、 chlortetracycline （金霉素，CTC） 和doxycycline （強力霉素，DC）等。
2.2.4 b－興奮劑
為擬交感神經類藥物，該類興奮劑的受體為b2受體故得名。該類興奮劑可以促使肌肉骨骼肌血管壁擴張、支氣管和子宮平滑肌松弛。因而在獸醫(yī)臨床上b2興奮劑被廣泛用作支氣管擴張藥和子宮松弛藥，同時也被非法用作動物營養(yǎng)再分配的促生長劑。副作用，如：焦躁、震顫、過敏、神智不清、食欲不振、惡心和嘔吐等以及心悸、高血壓、心律失常、心動過速等心血管癥狀，其中擬交感神經類物質在組織中的溢出均可導致組織壞死。
2.2.5雌激素
是一種人工合成的非固醇類雌激素，主要用于治療婦科紊亂、乳房和前列腺惡性腫瘤，為一種致癌物質；在肝臟中代謝緩慢，zui終能隨尿和糞便排出。副作用包括：水腫、引起性欲沖動、改變月經周期、乳房異常發(fā)育、肝功能改變、胃腸道紊亂、衰竭、頭痛、皮膚紅斑、風疹。對于雄性動物來說，大劑量的雌激素可以增加血管栓塞的危險。此外，雌激素還能引起子宮內膜增生，使患子宮癌的頻率增加。大劑量使用雌激素還可以導致骨骼發(fā)育閉合，停止生長。也能促使生殖道變形，對于雄性動物能使精子變形以及嘔吐等。
2.2.6氨基甙類抗生素
主要包括慶大霉素、鏈霉素、新霉素、卡那霉素等，為以氨基環(huán)醇和氨基糖相連成核糖單位的多價陽離子復合物。氨基甙類通過與細菌核糖體不可逆結合而干擾細菌蛋白質的合成，進而導致細胞膜塌陷。氨基甙類藥物的主要副作用是對聽覺器官和腎的毒性、過敏反應以及對神經肌肉的影響。其中，慶大霉素能引起肝功紊亂、外周和中樞神經炎（包括腦炎、呆滯、抽搐）；鏈霉素能導致神經紊亂，包括視覺神經炎和外周神經炎，以及嚴重的皮炎、過敏等超敏感反應。
二、獸藥殘留的快速檢測方法
目前上對抗生素和激素類藥物殘留的檢測主要有儀器分析法（包括HPLC和GC-MS）和生物學快速檢測法（如：ELISA、RIA、CharmⅡ等）。其中，儀器分析法既要求儀器設備具有相當高的精度，也要求技術人員具有一定的操作和分析技能。作為儀器分析法，其昂貴的價格和軟件更新的緩慢以及操作上的煩瑣限制了此法的推廣；但由于檢測的靈敏度可以達到ng水平，在一些國家大型實驗室里仍作為檢驗的參考依據(jù)使用。而生物學快速檢測法由于其操作上的簡便、快速以及達到ng水平的靈敏度等優(yōu)點，以成為動物產品中獸藥殘留檢測的一種重要手段。尤其是ELISA（酶聯(lián)免疫吸附試驗）和CharmⅡ，其操作上的簡便、快速和強烈的信噪比、達到ng水平的靈敏度等優(yōu)點，其缺陷在于該法會出現(xiàn)假陽性結果，但做為一種快速篩選方法備受技術人員的青睞，在檢測部門有著廣泛的應用前景。
1、ELISA檢測
1.1 所需儀器設備
酶標儀：常用的有美國的bio-lab（百樂），Bio-Tex,芬蘭Labsystem等，價格在5萬人民幣左右；
氮氣吹干儀：美國 Organomatic Associates，2萬左右；
洗板機（不一定要配置）：與酶標儀相應，價格在3-4萬人民幣左右；
離心機：6000g/min，國產價格在5000左右；
均質器：德國IKA，人民幣6000左右；（拍式均質器：1-2萬）
移液器：單道：1550/件，多道：5000/件；
恒溫培養(yǎng)箱：
固相萃取儀：
1.2常用ELISA試劑盒
英國朗道（RANDOX），德國拜發(fā)（r-Biopharm），德國Riedel-deHaen，荷蘭E-D，美國NEOGEN，意大利Tecna等。
1.3檢測原理（競爭法）
1.3.1 抗原抗體的基本結構
1.3.2檢測的基礎是基于抗原抗體的膠體特性與極性基的吸附作用。抗體的蛋白質（免疫球蛋白），大多數(shù)抗原也是蛋白質，在水溶液中都具膠體特性，并帶電荷，形成相對穩(wěn)定的親水膠體。同時抗原、抗體含有羧基、氨基及肽鏈等極性基團，當兩者由于理化特性相吻合互相吸引而結合后，成為憎水膠體系統(tǒng)。抗原和抗體的相互吸引和結合是依靠下列各種分子間引力所促成：
庫侖吸引力/靜電引力，抗原和抗體分子相反電荷的氨基和羧基之間相互吸引而促成；
范德華引力，由于抗原和抗體分子的外層電子之間相互作用的擾動產生一種引力，引起分子吸引而發(fā)生結合，這種作用取決于分子的空間構型；
氫鍵結合作用，具-OH、-NH2、-COOH等親水基團的抗體和相應的抗原接近時，可形成相對微弱和可逆的氫鍵橋梁，使得抗原抗體結合；
疏水作用，抗原抗體分子側鏈上的某些氨基酸（如亮氨酸、頡氨酸及苯丙氨酸等）為疏水基團，當抗原抗體分子表面上的這些疏水基團密切接觸時可排除水分子，在兩者之間產生相互吸引力而發(fā)生結合。
1.3.3抗原抗體的結合具有：
特異性：取決于抗原決定簇的數(shù)量、性質和立體構型；抗體Fab段的高變區(qū)和相應抗原決定簇的結合能力. 所以抗原抗體的種類質量直接影響結果
可逆行: 結合僅是分子表面的結合,而非共價鍵的結合,具有相對穩(wěn)定性但為可逆反應.一定條件下（低PH、冬融、高濃度鹽等）所以緩沖液很重要
zui適比例性：兩者量需具一定的量比關系才發(fā)生zui強的結合反應。所以抗原抗體的數(shù)量也是重要因素
反應具階段性：受環(huán)境中電解質、溫度、PH、等因素的影響。所以在ELISA實驗時各種步驟一定要準確到位。
1.3.4以氯霉素為例：
酶標板包被針對兔IgG（氯霉素抗體）的羊抗體。加入氯霉素抗體，氯霉素酶標記物，氯霉素標準液或樣品溶液。游離氯霉素與氯霉素酶標記物競爭氯霉素抗體結合位點，同時氯霉素抗體也與固定的羊抗體結合。沒有結合的氯霉素酶標記物在洗滌步驟中被除去。將酶基質和發(fā)色劑加到板孔中并孵育。結合的氯霉素酶標記物將無色的發(fā)色劑轉化為藍色產物。加終止液后使顏色由藍變黃。用450nm判讀，吸光度值與樣品中氯霉素含量成反比。 大多數(shù)試劑盒包被的是二抗。
RONDOX的試劑盒是直接將氯霉素特異性抗體預包被酶標板上，當在酶標孔中加入樣品和酶標記氯霉素后，樣品中的氯霉素和酶標記氯霉素競爭抗體結合位點，洗滌后底物顯色，加酸終止之后，顏色由藍變黃。用450nm判讀，顏色深度與樣品中氯霉素含量成反比。
不同的ELISA原理直接影響其檢測下限、特異性及結果的計算。
1.4 樣品的前處理
不同樣品有其特定的前處理方法，主要有以下幾種：
1.4.1有機物抽提法：（氯霉素）
利用藥物在有機物中的溶解性，達到分離純化的目的
樣品均質 稱量 乙晴和或乙酸乙酯抽提 離心 吹干
異辛烷/氯仿或正己烷抽提 離心 取水相分析
1.4.2離子交換法（如：C18過柱法）（鏈霉素）
離子交換是利用一些帶離子基團的物質，吸附交換帶相反電荷的蛋白質，將蛋白質按所帶電荷不同或量的差異分成不同的組分。
樣品稱量 溶解 上柱
C18柱平衡 洗柱 吸柱干燥 洗提 吹干
緩沖液重懸 分析
1.4.3（免疫）親和層析（雌激素）
利用生物大分子的生物學特性而設計的層析分離技術，如利用抗原和抗體、酶和酶的抑制物或配體、激素和受體等之間的親和力，在一定條件下，兩者可緊密結合形成復合物，若將其中一者固定在載體上，則可從溶液中提取和分離相應的另一方，并達到很高的純度。現(xiàn)有商品化生產，（方便，減少裝柱等繁瑣步驟）其操作步驟與上者相似，可以按照試劑盒提供的步驟進行。
1.5酶標免疫分析程序（室溫20-240C條件下操作）
每一個盒中的試劑足夠進行96個測量（包括標準測定孔），以E-D CAP檢測試劑盒為例：
1）取出試劑盒恢復至室溫，充分混均；
2）釋緩沖液（以ddw）稀釋備用（也可用磷酸鹽緩沖液，但要）；
3）洗緩沖液（以ddw）稀釋備用，也可用PBST（磷酸鹽土溫—20緩沖液）；
4）酶標記物的配制：按試劑盒說明配置、混均，2-8度陰暗處保存；
5）抗體的配制：按試劑盒說明配置、混均，2-8度陰暗處保存；
6）取足夠的微空條，記錄加樣順序；
7）a．吸取100微升稀釋緩沖液A1、A2（試劑空白），
b．吸取50微升稀釋緩沖液到B1、B2（零標準），
c．吸取50微升標準液到C—H孔，
d．加50微升樣品到其余孔；
8）加酶標記物和抗體到除A1、A2的所有孔；
10）蓋膜，震蕩1分鐘；
11）在一定條件下孵育；
12）洗板，一定要*充分，并且次數(shù)固定，推薦用洗板機（百樂）；
13）加底物，室溫培養(yǎng)（25度）孵育；
14）加終止液；
15）450nm波長下讀數(shù)。
1.6標準曲線的繪制
a．每個標準液或樣品的OD值均要減去空白A1、A2的OD值，
b．標準液和樣品的OD值除以零標準（B1、B2）的OD值
c． 繪制半對數(shù)曲線（以B/B0為Y軸，標準樣品濃度的對數(shù)為X軸），可用一些專業(yè)軟件，也可用半對數(shù)紙或在EXCEL上繪制。
2、CharmⅡ檢測
CHARM II 6600/7600分析儀是一臺多功能、單樣品的液體閃爍（LSC）和生物發(fā)光計數(shù)器。該法具有快速、簡便的特點，但其假陽性率教高，適宜快速篩選
2.1儀器組成：
Charm II 6600 / 7600分析儀
Charm孵育器
CentraCL2離心機
均質器、移液器
2.2 檢測原理
微生物受體免疫分析法，屬于免疫分析法的一種，其建立的基礎是藥物功能團與微生物受體位點的結合反應。在某些方面類似于放射免疫分析（RIA），所不同的是RIA使用抗體作為結合劑，而受體分析則是使用細菌細胞的固定位點當做特殊的結合劑。
一個單一的細菌細胞含有可結合藥物的特殊結合位點，藥物和受體位點的結合反應離解常數(shù)低，因而具特異性和靈敏性。對于該法具體原理Charm公司未有詳細深入的報道（商業(yè)方面考慮），主要是利用兩種不同的細菌提供7大類抗生素結合的必須位點，藥物的功能團與位點有關，不象免疫分析只涉及到側鏈，一種微生物受體可結合一類藥物的所有藥物。
象ELISA類似，這種結合也是一種競爭結合。在試管中加入一定量的細菌（受體）、放射性標記藥物和樣品，樣品中的藥物和放射性標記藥物競爭結合受體，未于受體位點結合的標記性藥物在讀數(shù)前被去掉，加入閃爍液，在分析儀上讀數(shù)。
2.3檢測的一般程序
2.3.1準備工作：首先按說明書配制好所需的提取緩沖液、M2緩沖液、陰性對照和陽性對照。
儀器零點測定：用空試管測定儀器的零點是否正常。
試劑和儀器有效性確認：檢測陰性對照液和陽性對照液各3次，求出cpm值的平均值，與出廠的計數(shù)單對比，能在其±10%左右波動。如果與計數(shù)單相比偏移較大，試劑可能部分失效，但只要陽性平均值/陰性平均值小于0.7，試劑仍然可用，但靈敏度會有所降低。
控制點的確定：控制點是陰性結果與陽性結果的臨界值。利用控制點來判斷結果。有兩種確定控制點的方法：根據(jù)樣品的種類或檢測水平選擇適當?shù)目刂泣c確定方法。控制點確定方法有二。有些說明書上兩種方法都列出，用戶可根據(jù)需要選擇，選第二種。
方法一：直接以陰性對照來確定控制點，一般樣品干擾小或接近儀器的下*，采用這種方法，只需再做3次，與前3次試劑性能確認的結果一起求平均值，然后減法X%，即為控制點。X為變數(shù)，由廠家用定量方法校準。
方法二：以空白加標樣品來確定控制點。這種方法的關鍵是找到陰性樣品，如果沒有其它的定量方法找陰性樣品，可根據(jù)陰性對照平均值來找陰性樣品（陰性對照平均值±X%）。用此陰性樣品，按檢測水平和稀釋倍數(shù)，加抗生素標準品，用此空白加標樣品，測定6次CPM值，求平均值，控制點＝平均值＊（1＋20%）。
2.3.2測定實際樣品
前處理：不同的樣品具不同的前處理方法，一般尿樣、血清、血漿等只需用緩沖液稀釋即可，而組織樣品則需均質、提取、孵育等過程，對于蜂蜜等一些樣品則要過柱。總的來說，前處理要比ELISA更簡便、快速。
按照操作說明檢測結合試劑片加入試管；加入300微升水混均；加入處理過的樣品；加入標記性藥物，混合；孵育；離心，棄去上清液；加水混均；加閃爍液，混均；讀數(shù)。
三、實驗室分析質量控制
涉及儀器的校正、過程控制、標準物控制、環(huán)境、實驗室管理（監(jiān)控所進行的測試及記錄結果，以便發(fā)現(xiàn)發(fā)展趨勢，統(tǒng)計技術進行結果評審）
1、快速篩選方法及定性方法
選擇性：檢出目的物質的能力；
靈敏性：樣品中檢出這種藥物真正陽性結果的比率；
準確性：所得值和真實值的一致性，用不確定度來衡量——重復多次測定值和真實值之差；
檢測限：分析方法能從樣品背景信號中檢測出待檢物質的zui低濃度；
重復性：
2、定量方法的附加要求
回收率：
定量限：分析方法能對樣品中待檢物質進行定量檢測的zui低濃度，反映該方法在低濃度端分析結果的可靠性；
精密度：對同一樣品重復測定，每次測定值和均值的接近程度，主要反映隨機誤差；
重復性：批內重復、批間重復線形范圍：曲線的擬和
